据已发现的化石研究分析，早在800万年前的晚中新世，中国云南禄丰等地的热带潮湿森林的边缘，就生活着大熊猫的祖先――始熊猫（Ailuaractos Lufengensis），这是一种由拟熊类演变而成的以食肉为主的最早的熊猫，个体犹如一只较肥胖的狐狸。由始熊猫演化的一个旁枝叫葛氏郊熊猫（Agriarcros goaci），分布于欧洲的匈牙利和法国等地的潮湿森林， 在中新世末期即灭绝。而始熊猫的主枝则在中国的中部和南部继续演化，其中一种在距今约300万年的更新世初期出现，体型只有现生大熊猫的一半大，像一只胖胖的狗，其化石被定名为大熊猫的小种（Ailuropoda micrta）。从大熊猫小种的化石牙齿推测，它已进化成为兼食竹类的杂食兽。
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始熊猫舌面
这些小型大熊猫又经历了约200万年，开始向亚热带潮湿森林延伸，并取代始熊猫广泛分布于云南、广西和四川。以后大熊猫进一步适应亚热带竹林生活，体型逐渐增大，距今50-70万年的更新世中、晚期，是大熊猫的鼎盛时期，化石大熊猫武陵山亚种（Ailuropoda milanoleuca wulishansis）的体型仅比现生大熊猫小约１／８。到更新世晚期，化石大熊猫巴氏亚种（Ailuropoda milanoleuea daconi）的体型又普遍的比现生大熊猫大约１／８，而且依赖竹子为生。
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大熊猫小种下颌化石
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武陵山亚种下颌
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巴氏亚种头骨化石
在整个更新世，化石亚种大熊猫分布相当广泛，几乎遍布中国东部和南部，北至北京周口店，南至台湾岛及缅甸、越南、泰国北部。当时的大熊猫与剑齿虎、剑齿象以及北京猿人、南方猿人一起生活，构成典型的更新世大熊猫――剑齿象动物化石群。就在更新世中晚期，秦岭及其以南山脉出现大面积冰川等自然环境的剧烈变化，特别是在距今约1万8千年前的第四纪冰期之后，大熊猫――剑齿象动物群衰落，大部分动物灭绝，仅留下无数化石表明它们曾经存在。北方的大熊猫绝迹，南方的大熊猫分布区也骤然缩小，进入历史的衰退期。
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